今回wndchrmをインストールしたMacのOSXはYosemiteですが、大概のOSXで動くと思います。まずはツールをインストールするための準備。以前の記事の「NGSデータをIGVブラウザで見るまで」の「Section III NGS解析環境づくり-基本Mac OSXの場合」のところにありますが、Xcode、Command Line Tools、homebrewがインストールしてあることが前提です。

んー、これなんか見た目違うなあ、でもどう違うか説明しろと言われても、、、

顕微鏡観察をしていると、こういう状況に良く遭遇します。ものすごくはっきりとした違いであればコントロール、実験区、それぞれ写真をバーンと出してどんなもんだいと胸を張っていれば良いのでしょうが、微妙な差である場合はrepresentative imagesですよ、っといって出したとしても、レフリーを納得させることは至難の技です。そういう時にもしかすると切り札となるかもしれないツール、wndchrmを紹介します。

うまくいっているときはプロトコールを変えないのが鉄則です。しかしながら、ついつい良さそうな噂を聞きつけると試したくなるのも心情。かといって、そんなことばかりしていては肝心の仕事は前に進みません。僕らが使っているin situ hybridizationのプロトコールはかれこれ20年ぐらい何も変えず、それでうまくいっていたので今更いじるところもなかろうと思っていたのですが、衝撃の事実が。。。

IGVは濡れねずみ研究者にとってとっても便利なツールで、難しい統計学はわからないけれども見ため勝負、顕微鏡観察には自信あり、なんていう研究者にはとっておきのNGS解析インターフェイスなわけですが、できるはずのちょっとしたことができなかったりして右往左往してしまったのでおなじみ恥さらしのNGS覚え書きシリーズです、、、

SIMは構造照明をあてた複数の画像から計算で高解像の画像を再構築します。したがって、シグナル、つまり光が全て計算通りにサンプルの中を進むような条件を作り出してやることが非常に重要になります。そのために必要なのが、適切な厚さ（0.17 mm）のカバーグラスを使うことと、適切な屈折率を持つマウント剤を使用することです。現状、様々なマウント剤がSIMで「使える」ことになっていますが、コスト面、クオリティ面、いろいろ考えると、マウント剤はTDEがベスト!!です。というか、TDE以外のマウント剤では綺麗なパラスペックル像を得ることはできませんでした。

超解像顕微鏡は解像度が上がる分、ピクセルあたりのシグナルは当然弱くなるので、明快なイメージを得るためには通常の抗体染色よりも強いシグナルが必要となります。とはいえ、抗体染色の良し悪しは抗体の性能に大きく依存するので、濃度を上げる、反応時間を長くする、といった小手先の工夫では大して変わらないというのも事実です。抗体が染まらんかったら自分で作れ！！これこそが学生時代から叩き込まれた王道、という方も多いのではないでしょうか。

カバーグラスを洗うやり方としては
１）硝酸や硫酸などの強酸
２）ただの洗剤
があって、プラスミド精製に例えるなら１）がセシウム、２）がキアゲンみたいなところがあるというのは前回書いた通りなのですが、そもそもの問題として、あんなに激しくシャカシャカして、傷かつかないかということなのですが、気になるので顕微鏡で覗いてみました。

僕はNGS解析の専門家ではありませんが、たぶんこれ、ここ数年のうちにPCR並に当たり前の技術になるでしょうから（学生のころはPerkinElmerのPCRマシーンが眩しかった、、、）、猿でも出来るレベルのNGS解析の解説記事を不定期でアップしていこうと思います。以下、埼玉大及び熊本大学の集中講義で使用した資料です。

超解像顕微鏡。四ッ谷のZeissのショールームにせっせと通い、わんさかデータを撮ってもらい、これで論文書けるなら顕微鏡買わんでもいいやんかとかいうワルい考えもふと頭をよぎりましたが、無事、当新学術の総括班の予算で設置されることになり、よかったよかった、です。これからはこいつを使い倒すぞ！ということで、宝の持ち腐れにならないよう、どなたさまもご気軽にご相談下さい。