原核生物のCRISPR-Cas免疫機構は外来核酸に対する防御を担っています。II型CRISPR-Cas系においては、Cas9タンパク質がガイドRNA（CRISPR RNAとtrans-activating CRISPR RNA）と複合体を形成し、CRISPR RNAと相補的な標的二本鎖DNAを認識・切断します。Cas9はゲノムDNAの狙った位置を切断することができるため、近年、ゲノム編集ツールとして広く利用されています。異なる生物種に由来するCas9のアミノ酸配列は多様であり、認識するガイドRNAの塩基配列も大きく異なります。しかし、Cas9の作動機構には謎が多く残されています。本研究では、Cas9-ガイドRNA-標的DNA複合体の結晶構造を決定し、CRISPR-Cas9系の多様性を原子レベルで解明したいと考えています。
ncRNAはlncRNAやsmall RNAだけではありません。近年、古典的なncRNAにも制御性ncRNAとしての第２機能がある可能性が注目されています。我々は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた研究から、mRNAの安定性がORFのコドン組成によって規定されていることを見出しました。この発見は、コドンを読み取るtRNAに遺伝子発現を動的に変化させる制御性ncRNAとしての機能が備わっていることを意味しています。本研究では、ゼブラフィッシュ初期胚を用いた実験系を駆使し、コドンとtRNAがmRNA安定性に及ぼす効果の定量的な検証によって、制御性ncRNAとしてのtRNAの特徴を同定します。またコドン効果のin vivo可視化系を構築し、遺伝子発現の組織特異性を生み出すポテンシャルを秘めた制御性tRNAを探索します。古典的ncRNAに隠された個性とその多様性に焦点をあてることで、tRNAの新たな機能的分類「tRNAネオタクソノミ」を目指します。
真核生物の遺伝子には、品質管理機構によって速やかに分解されるノンコーディングmRNAをmRNA前駆体の選択的プロセシングにより積極的に発現することで遺伝子発現量が制御される例があります。私たちは、線虫をモデル生物としてそのようなノンコーディングmRNAを探索し、アミノ酸代謝経路の酵素をコードする遺伝子のノンコーディングmRNAの発現がフィードバック制御を受けること、さらに、食餌と絶食によってコーディングmRNAとノンコーディングmRNAの比率が可逆的に大きく変動することを見出しました。このことは、食餌や体内代謝環境に応じて代謝酵素の発現量をmRNAの転写後プロセシングの段階で動的に制御する未知の機構の存在を示唆しています。この研究課題では、食餌や絶食に応答してノンコーディングmRNAを産生する選択的プロセシング制御機構の作動装置と作動エレメントの実体を解明し、代謝酵素の発現がノンコーディングmRNAの産生を介して食餌により動的に制御されることの生物学的意義を明らかにすることを目指します。
トランスポゾンは、正常な個体発生や生命の次世代継承にとっての重大な脅威となります。こうした遺伝子を選択的に抑制する因子として、PIWI-interacting RNA (piRNA)と呼ばれる、生殖組織で発現する非コード小分子RNAが知られています。私はこれまでの公募研究成果として、piRNAとPIWIタンパク質の複合体によるトランスポゾンの発現抑制が、複数のパスウェイが制御するクロマチン凝集によるものであることを明らかにしてきました。これを受けて現在、piRNA-PIWI複合体はゲノムの三次構造やヒストン修飾の制御を介したヘテロクロマチン形成により、遺伝子発現プロファイルをダイナミックに変動させていると考えています。本研究では、PIWI-piRNAが形成するクロマチン状態の包括的な解析と関連因子のスクリーニングをオミクス解析技術により行い、さらに、個々の因子の詳細な機能解析を生化学実験により行うことで、核内非コード小分子RNAによる高次クロマチン構造変換の「作動装置」の解明を目指します。
哺乳類のメスにおけるX染色体不活性化は長鎖ノンコーディングRNAであるXistがX染色体を覆うことで引き起こされます．我々はXist によるヘテロクロマチン形成機構を明らかにするために，Xistの機能に不可欠な作動エレメントにあたる領域を欠失した変異型Xist RNAをマウス胚で内在性Xist遺伝子座から発現させました．その結果，変異型Xist RNAはX染色体を覆いはするものの，これを正常に不活性化できないことがin vivoで初めて確認されました．興味深いことに，そのX染色体のヒストン修飾を免疫染色で調べると，正常な不活性X染色体と区別がつかない，ヘテロクロマチン様の構造が構築されていることがわかりました．このことから，変異型Xist RNAは偽ヘテロクロマチンとも呼べる一見凝縮した構造を構築できるものの，そのクロマチン状態はX染色体連鎖遺伝子を正しく抑制できるものではないと考えられます．本研究では，Xist RNAの作動エレメントの有無がもたらすこうした差の実態を明らかにするため，野生型のXist RNAで覆われる正常な不活性X染色体と変異Xist RNAで覆われるX染色体の間のエピジェネティックな状態染色体ワイドに比較し，遺伝子発現との相関を明らかにします．
我々は翻訳とmRNAの安定性を同時に評価可能なin vitro miRNA評価系の構築を行い、miRNAによる翻訳開始抑制時に、翻訳開始過程のどのステップが標的とされているのか、またどのような因子を標的としているのかを、mRNA-タンパク質複合体（mRNP）pull-down法を開発し、解析してきました。その結果、miRNA存在下においては、翻訳開始複合体eIF4Fの構成因子であるeIF4Aが、eIF4F複合体から除外されていることを証明しました。しかしながら、miRNA反応マシナリーがどのようにしてeIF4Aを翻訳開始複合体より解離させているのかについては依然不明です。miRNA反応マシナリーが翻訳開始を抑制する作動原理の全容解明のためには、miRNA反応マシナリーがどのようにして翻訳開始複合体よりeIF4Aを解離させているのかを明らかにすることが必須です。そこで本研究計画では、申請者がこれまでに構築した生化学実験系を駆使し、miRNA反応マシナリーがeIF4FからeIF4Aを離脱させ、翻訳開始を抑制する作動原理の解明に取り組みます。
心不全の病態形成に慢性炎症が関与し、心不全や心筋梗塞の際は、心臓内で増加する炎症型マクロファージが組織再構築を起こして心機能を低下させると考えられています。一方で、我々は心臓マクロファージが心臓の病態形成と恒常性の維持の両面で働くことを見出しました(Fujiu et al, Nat Med 2017)。このことから、心臓ストレスに対してマクロファージが炎症型から炎症収束型に速やかに移行すれば心臓恒常性が維持されるが、炎症収束型に移行できないと炎症が遷延し、心疾患を発症すると考えました。我々はマクロファージにおいて機能する長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)に着目し、特にその作用様式に着目して詳細に検討し、lncRNA の新しい性質・機能を理解するともに、マクロファージのlncRNA による制御を標的として、心血管疾患の新規治療法開発の基盤を構築することを目的とします。
生殖期特異的に発現するイネの771種のlarge intergenic non-coding RNA (生殖lincRNA) 内には、microRNA (miR2118) が認識する共通配列, 作動エレメントが存在します。生殖lincRNAsは、miR2118切断を介してプロセシングされ、21塩基毎のsmall RNA (phasiRNAs: phased small interfering RNAs) が生成されます。植物の初期生殖細胞の発生に関する知見は乏しく、生殖lincRNA, miR2118, phasiRNAの機能等は明らかとなっていません。本研究では、現在までに作成した50系統を超える変異豊富なnon-coding RNAバリエーションイネから、生殖に重要な変異やphasiRNAを絞り込みます。さらに、選抜されたnon-coding RNA配列を基に、phasiRNAsの翻訳抑制、細胞内局在制御、生殖lincRNA制御等の検証を行い、生殖lincRNA/miR2118/phasiRNAの機能とその生殖分子制御を解明することを目的としています。
近年、哺乳類ではタンパク質をコードしないnon-coding RNA（ncRNA） が発生、分化、病気などの生命現象に深く関わっていることが明らかになってきました。この内200塩基以上の長いncRNA（long non-coding RNA, lncRNA）は哺乳類の発生に必須な「ゲノムインプリント」や「X染色体の不活性化」等のエピジェネティックな現象に関与し注目されています。しかし、個体レベルで生理機能が明らかになっているものは稀で、その役割の解明が求められている状況です。これまで我々はゲノムインプリントを受けて父親由来のX染色体からのみ発現するlncRNAを複数同定することに成功しています。それらlncRNAがどのような機能を持つのか？を調べるためKOマウスを作製したところ、ほぼ雌の個体でのみ異常が観察され、雌雄間で表現型の性差が見られるマウスがいることを突き止めました。本研究では、KOマウスを用いて①lncRNAの生理機能、作用機序の詳細を明らかにし、② なぜ表現型が性差を示すのか？について検証したいと考えています。生理機能を示すlncRNA KOの解析は、lncRNAの作用機構を理解するうえで重要な手がかりとなると期待されます。
中枢神経系において神経幹細胞と運動ニューロンに限局した発現パターンを有するRNA結合蛋白質のHITS-CLIP解析を行い、標的遺伝子群に対する選択的スプライシング制御メカニズムと新規の神経幹細胞性維持に関わるRNA作動エレメントを介したシグナル経路を同定しました。その一方で、予想以上に機能未知のオーファン CLIPedクラスターがイントロン領域及びインタージェニック領域に存在することが明らかになりました。その一部は、Circular RNAの生合成、mirtronの制御に分類され、その他はlong non-coding RNA、enhancer RNAを含む核内non-coding RNA (ncRNA)への作用機序をもつものと類推されています。そこで、本研究では自己複製能を有する神経幹細胞と最終分裂を終えた運動ニューロンにおけるHITS-CLIPマップを比較しながら、細胞コンテクスト特異的なncRNA作動エレメントとncRNA制御機構を分類し、全く性質の異なる二つの細胞におけるncRNA作動エレメントと生理学的機能の解明を目指します。
循環器疾患の中でも、心肥大や心不全の病態は複雑な背景を有し、依然としてその根本的メカニズムは不明です。一方、長鎖非コードRNAが多様な生命現象において重要な機能を担っていることが明らかにされてきましたが、多くは機能未知であり、その全貌解明が待たれています。私達は、心肥大や心不全における長鎖非コードRNAの機能を解明するために、心肥大、心不全をきたしたマウス心臓で有意に上昇する長鎖非コードRNAを網羅的に解析しました。その結果、心肥大、心不全心で高発現し、筋特異的に作用するlincRNA (long intergenic/intervening non-coding RNA)の候補として、lincRNA-Hy5を同定しました。本研究では、この筋特異的lincRNA-Hy5が担う分子メカニズムを①心肥大や心不全において果たす役割、②骨格筋の分化システムでの作用の2点において、in vitro、in vivoにおいて解明することを目的とします。
私達は、環境依存的に性が決定されるオオミジンコにおいて、オスの性決定遺伝子dsx1の上流からdsx1と同様にオス特異的に発現しdsx1を活性化するlncRNA、DAPALR (dsx1 alpha promoter associated long RNA) を発見し、その生合成とdsx1活性化メカニズムの解析を行ってきました。生合成の解析では、DAPALR にはpoly-A が付加されず、これまでに報告されていないメカニズムで3’ プロセシングを受けている可能性を見出しました。一方で、転写活性化のメカニズムの解析では、dsx1の発現を正に制御する作動エレメントを明らかにしました。本研究では、3’ プロセシングおよび転写活性化を制御する作動装置を解明し、さらにこれらが他のlncRNA でも共有されてるかを検証します。これにより、ncRNA の新しいタクソンを確立することを目指します。
近年、長鎖ノンコーディングRNA（lncRNA）が多様な生命現象において重要な機能を担っていることが明らかにされてきましたが、多くのlncRNAは機能未知であり、その全貌は把握されていません。細胞分裂装置であり、中心体を形成中心とした分裂期紡錘体においても機能的RNAの関与が過去の知見から示唆されていましたが、その同定には至っていません。当研究室では、これまでに微小管ネットワーク-中心体に物理的に結合するlncRNAの探索を、次世代シークエンス技術と機能ゲノミクスを融合させることで網羅的に進めました。その結果、ヒト培養細胞における紡錘体形成、及び染色体分配に必要な新規lncRNAを同定しています。このlncRNAは微小管上に特異的に局在しており、動原体と微小管の効率的な結合、染色体分配に関与するという極めて新奇な性質を示しました。そこで、本研究課題においては、この新規lncRNAの構造RNAとしての機能、その作用機序を解明します。細胞分裂のような重要な生命現象に構造RNAが関与することを明らかにし、当該分野に新たな概念を提示することを目指します。
いくつかのRNAの機能が、配列ではなく、それらが織り成す構造によって規定されているように「作動エレメント」に加わる重要な要素としてRNAの高次構造があげられます。しかし高次構造を重要視した作動エレメントの解析手法、特に大規模解析手法は発展途上にあります。既存の手法では特定の細胞に内在するRNAを元に実験・解析を行うために、特定の細胞条件に依存した解析結果に陥る点や、高度に構造をとったRNAを十分に解析できない点に改良の余地がありました。加えて、網羅的検出技術が開発されていない機能性RNAも存在しており，RNAが有する多彩な機能への理解を阻んでいました。上述の問題を解決するために、本研究では独自に開発した「RNA構造ライブラリ」を用いて作動エレメントとして重要なRNAの配列と高次構造を網羅的に解析する新技術を創出します。さらに幅広い種類の機能に対してRNA構造ライブラリを用いた解析を実施することで、従来の機能性RNAの研究手法を革新し、配列と高次構造の観点からncRNAの機能アノテーションを拡充することを目指します。
近年、lncRNAがmRNAと相補鎖を形成する事で、相互作用するmRNAの発現を調節している事例が知られるようになってきました。そのため、lncRNAの関与するRNA-RNA相互作用を網羅的に調べる事が、機能未知lncRNAの機能を推定するために有用であると考えられます。しかし、数万種ものlncRNAの相互作用を全て実験で調べる事は困難であるため、バイオインフォマティクスによる相互作用予測が必要不可欠であるといえます。福永は近年、RNA-RNA相互作用を超高速に予測するソフトウェアであるRIblastを開発しました。RIblastは先行研究に比べて70倍近く高速であるため、現実的な計算機資源と時間で網羅的にRNA-RNA相互作用を予測する事が可能です。本研究では、このRIblastを利用してlncRNA-RNAの相互作用ネットワークを作成し、グラフアルゴリズムを利用する事で機能未知lncRNAの機能を高精度に推定する事を目的とします。また、RIblastによって予測された相互作用については、進化的保存性や組織特異的発現性、局在情報などを統合したデータベースとして、他研究者に使いやすい形で公開します。
多くのRNAは、タンパク質と複合体を形成して機能を果たすと考えられていることから、RNAの成熟、機能、運命決定の機構知るためには特定のRNAに結合するタンパク質を知ることがとても重要です。我々は特定のRNA/タンパク質複合体を精製、質量分析を用いRNAに結合するタンパク質を同定する手法の開発を行っており、本研究計画では、iSRIM法（in vitroにおいて特定のRNAに結合するタンパク質を同定する手法）及びCHIRP法（in vivoにおいて特定のRNAに結合するタンパク質を同定する手法）の両手法を比較しながら用い、特定のRNAに結合するタンパク質同定基盤技術の確立を目指すとともに、確立した技術を用い、RNAの成熟過程、機能、制御機構の解明を目指します。
