2014年09月24日(水)

染色のコツ

投稿者:
染色ならお手のもの。と、秘伝の技がいろいろあっても、超解像では全部忘れて、別の最適条件を探さなくてはいけないようです。
かつて秘伝のタレならぬ最強のノザンのハイブリバッファーを愛用していたのが、DIGのハイブリでEasy Hybriにあっさり負けてしまったことを思い出す今日この頃、、、
QBiCの岡田さんご指導ありがとうございました。実験医学のクローズアップ実験法(2014年10月号 Vol.32 No.16)に記事が出ていますね。
 

通常の抗体染色に比べ、1次抗体、2次抗体、共に4-5倍の濃度で用いるのが良い。
  • 一般的な2次抗体なら50x~ぐらい。
カバーグラスの上で細胞を培養する。厚さは0.17mm
  • 凍結切片であれば、PLLコートしたカバーグラス上に切片をとれば良い。
  • 通常のカバーグラス#1は0.12-0.17mmと若干薄いので#1.5を用いる。
  • Assistentでは0.17±0.01mmに厚さを揃えたものを安価で販売している。
最も良く染まる条件をきちんと出す。
  • 2次抗体はAlexa488/568Cy2/Cy3の組み合わせがおすすめ。(注:TDEでマウントするときはAlexa488は使えない
  • 1次抗体によって染色条件は千差万別。
マウント剤にTDEを用いるとAlexa488はの色が若干暗くなる印象がある暗くなるので使わない方が良い。
  • それでも使うのならCCDカメラのgainを上げる等で対応。
  • Prolong Goldがやはり便利か。高いけど。
  • whole mountのサンプルだとTDEによる透明化の効果が期待できるかも。
  • でも下のHarvardのリンク先の情報によればZの解像度はTDEの方が良いらしい。でもちょっと大げさな気がするなあ、、、ということで検討中。

TDEマウントでの色素のチョイスは2色ならばCy2-Cy3の組み合わせが良い!!

  • なんと驚くべきことにCyanine 系の色素はTDEマウントでむしろ明るくなる!
  • Cy2はProlong GoldマウントではAlexa488よりずっと暗いがTDEマウントでは立場逆転。
  • 詳しくはTDEのオリジナルの論文を参照。
  • 論文読んでから実験しろと、ちょっと前の自分に小一時間ぐらい問いつめたい。。。
  • optical effectを考えると現時点での最良のchoiceはTDEマウント、Cy2/Cy3染色。

TDEマウントするとDAPI染色のシグナルが消えてしまい困っていましたが、100ng1µg/mlぐらいでTDEマウント剤に混ぜておけば良いみたいです。

 

  • 論文読んでから実験しろと、ちょっと前の自分に小一時間ぐらい問いつめたい。。。
お役立ちリンク

Rainer Heintzmann Lab.
Harvard Center for Biological Imaging

最終修正日 2014年12月12日(金)
中川 真一

北海道大学薬学研究院 RNA生物学研究室

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