【計画研究1】ncRNA作動エレメントの配列構造の同定

細胞内構造体の構築機能を有するアーキテクチュラル(arc)RNAは、新しいタイプのncRNAです。本研究では、arcRNAを骨格にした巨大細胞内構造体の構築に関わるRNA配列とRNA-タンパク質ネットワーク形成機構を、クロスリンクRNA免疫沈降法やタンパク質間相互作用解析、さらには構成因子の機能阻害実験を通じて明らかにします。またこの構築過程のncRNAとタンパク質の会合を仲介するタンパク質複合体の作用機構を生化学的に解析すると同時に、複合体の細胞内での形成過程を超解像度顕微鏡を用いて直接観察します。さらに細胞分画とRNA配列解析を組み合わせた解析によって、新たなarcRNAを同定し、その機能配列と相互タンパク質情報を集約して細胞内構造体構築機能に必要な作動エレメントを抽出します。

分担者である富田は、ncRNA作動装置の構築や安定化に関わる重要なRNA-タンパク質相互作用を同定し、その構造基盤を明らかにします。また、特定の機能性RNAの成熟化や機能発現を制御するタンパク質を質量分析によって同定します。一例として、研究代表者と連携して、arcRNA機能を支えるRNA-タンパク質複合体を同定し、その共結晶を作成しX線回折法による分子構造解析を行います。

これらの研究を通して、RNAの機能配列・構造に基づいたncRNAタクソンを確立します。

廣瀬 哲郎 (HIROSE, Tetsuro)
  • 北海道大学
  • 遺伝子病制御研究所
  • 教授

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富田 耕造 (TOMITA, Kozo)
  • 東京大学
  • 新領域創成科学研究科
  • 教授

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【計画研究2】ncRNAのケミカルタクソノミ

細胞内のRNAは転写後に様々な化学修飾(RNA修飾)を受け、その本来の機能を発揮することが知られています。RNA修飾はRNAに物理化学的な性質を付与し、細胞内における安定性制御、細胞内局在の決定、RNA結合タンパク質との相互作用、RNAプロセシングの制御、遺伝暗号の解読、翻訳調節、遺伝情報の変化、自然免疫からの回避など、様々な生命現象に関わっています。

このようなRNA修飾がncRNAの機能を規定する作動エレメントとして働いているかどうかを検討するため、各種ncRNAを生化学的に精製して高感度質量分析を行い、RNA修飾の化学構造及び修飾部位の同定を行います。新規のRNA修飾については、修飾酵素を生化学的に精製することにより、生合成経路を明らかにします。

さらには、RNA修飾を特異的に認識するタンパク質(Reader)を同定して詳細な細胞内局在解析や機能解析を行い、ncRNA作動装置の形成と機能のために必要なRNA修飾を同定します。また、RNA修飾によって機能が獲得されたncRNA作動装置の生理的な役割を解明することによって、RNA修飾の化学特性に基づいたncRNAケミカルタクソノミを確立します。さらには、修飾塩基を特異的に認識する抗体や化合物を用い、RNA修飾をゲノムワイドに解析するための新しい技術開発も行います。

鈴木 勉 (SUZUKI, Tsutomu)
  • 東京大学
  • 工学系研究科
  • 教授

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【計画研究3】ncRNAの細胞内局在に基づいたネオタクソノミの確立

RNAポリメラーゼIIによって転写されるmRNAや様々なncRNAが、どのように細胞内で選別され、機能するのかは不明です。そこで、ncRNAの細胞内局在の決定機構に注目し、その特異性を指標にしたncRNAタクソンを確立します。

研究代表者の塩見は、生殖ゲノムの保持に関わるPIWI-interacting RNA(piRNA)の前駆体を取り上げます。piRNAは、Yb bodyやNuageといった細胞内構造体で前駆体のncRNAからプロセシングを受け、それによって作動装置であるpiRNA RISCが形成されます。そこで、piRNA前駆体を特異的に認識し細胞内構造体に運ぶためのRNA配列を同定し、そこに結合するタンパク質による細胞内局在の決定機構を解明します。

研究分担者の大野は、RNA輸送経路の観点からmRNAとncRNAの選別機構を研究します。mRNAは核外輸送を受けますが、ncRNAには核に留まるものがあります。そこで、これまで手つかずのmRNAとncRNAの仕分け機構を明らかにします。そのために、哺乳類細胞の核に豊富に存在するarcRNAなどのncRNAに焦点を合わせ、一般的なmRNA結合タンパク質がそれらncRNAに結合しているかどうかについてのカタログを作成します。ncRNAから排除されている特異的なタンパク質が見つかれば、その排除に働くncRNAの配列や構造を同定し、その識別機構を明らかにします。

これらの解析を通して、ncRNAの生合成過程の分子識別機構を規定する作動エレメントを同定し、ncRNAネオタクソノミに基づいた機能解析を進めます。

塩見 美喜子 (SIOMI, Mikiko)
  • 東京大学
  • 理学系研究科
  • 教授

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大野 睦人 (OHNO, Mutsuhito)
  • 京都大学
  • ウイルス研究所
  • 教授

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【計画研究4】ネオタクソノミに応じたncRNAの生理機能の解明

arcRNAタクソンは、核内に大量に蓄積し特定の核内構造体の骨格となる一群のncRNAの総称です。arcRNAの機能はこれまで主に培養細胞および初代培養で解析されてきましたが、実際に個体レベルでどのような生理機能を果たしているか、長らく不明でした。

本研究では、代表的なarcRNAであるNeat1、Malat1、Gomafuのノックアウトマウスの表現型解析を行い、arcRNAが制御する細胞内プロセスの詳細を明らかにします。特に、核内構造体パラスペックルの骨格因子であるNeat1ノックアウトマウスが、黄体機能不全による著しい妊孕性の低下という表現型を示すことが明らかになりつつありますので、この系をモデルシステムとして用い、arcRNAとその結合タンパク質が作る超分子複合体が制御する細胞内プロセスを、生化学的解析や複合体の細胞内挙動の詳細な解析を通じて明らかにします。

また、特定のRNAに対するアンチセンスオリゴDNAを用い、RNA-タンパク質超分子複合体をシステマティックに精製する技術を確立することを目指します。また、そこで培われた基盤技術は、領域内で同定されたその他のarcRNAタクソンに属するncRNAの機能解析にも応用していきます。

さらに、計画研究1や計画研究2と連携し、新規に同定されたRNA修飾酵素やarcRNAのノックアウトマウスを作製し、個体レベルでの機能解析をすすめていきます。

中川 真一 (NAKAGAWA, Shinichi)
  • 北海道大学
  • 薬学研究院
  • 教授

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【計画研究5】高次神経機能制御に関わるncRNA機能の解明

脊椎動物を含む多くの高等動物において、神経系特異的に発現するncRNAが数多く同定されており、これらは神経回路形成・作動において機能する単一のncRNAタクソンを形成している可能性があります。本研究は、遺伝学的手法を用いた効率的な解析が可能であるショウジョウバエをモデル系として、ncRNAによる高次神経機能の制御機構の解明を目的とします。

現在までに、14種類の神経系特異的ncRNAを同定しており、そのうちの一つ、Lobe-less RNAが、学習・記憶の脳内中枢であるキノコ体の形態形成に必須であり、神経回路の形成に重要な役割を果たしていることが明らかになりつつあります。Lobe-less RNAをはじめとするこれら神経系特異的ncRNAの突然変異系統において、神経回路形成における表現型を詳細に解析し、細胞レベルでの作動原理を明らかにします。また、上記ncRNA変異系統の表現型を指標に、これと強い遺伝学的相互作用を示す突然変異のスクリーニングを行い、ncRNAとの相互作用を生化学的に検証することで、作動装置の構成要素を明らかにします。

これらの研究によって得られた情報から共通の作動エレメントを同定することにより、高次神経機能を制御するncRNAタクソンを確立します。

影山 裕二 (KAGEYAMA, Yuji)
  • 神戸大学
  • 遺伝子実験センター
  • 准教授

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【計画研究6】ncRNA作動装置構築の分子動態解析基盤の開発

代表的なncRNAであるsiRNAは、Argonaute (Ago)タンパク質と会合し、RISCと呼ばれるRNA-タンパク質複合体を形成することにより、配列依存的に標的mRNAを切断しその発現を抑制します。これがRNA干渉と呼ばれる現象です。RISCの形成は、siRNAがAgoに自発的に取り込まれて起こるのではなく、Hsc70/Hsp90を中心とするシャペロンマシナリーの働きによるAgoのダイナミックな構造変化が必須であると考えられます。

近年、一本鎖RNAを含んだヒトや酵母のAgoの結晶構造から、形成されたRISCの安定なスナップショットが明らかにされましたが、そこに至るまでの過程、すなわち、小分子RNAとAgoがシャペロンマシナリーの力を借りながらRISCを形成するまでの、中間状態の順序や構造変化の詳細、あるいはそれら各ステップに必要なタンパク質因子やsiRNAの化学特性などは不明です。

本研究では、泊らが独自に開発したRISC形成の試験管内再構成系をもとに、RISCが組みたてられる一連の過程を、一分子イメージング法によって観察することにより、siRNA作動装置であるRISCの構築と作動における動的基盤を理解します。さらには、arcRNAを含む様々なncRNA-タンパク質複合体形成の分子動態を解析する汎用的な技術の開発を目指します。

泊 幸秀 (TOMARI, Yukihide)
  • 東京大学
  • 分子細胞生物学研究所
  • 教授

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多田隈 尚史 (TADAKUMA, Hisashi)

  • 大阪大学
  • 蛋白質研究所
  • 助教

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【計画研究7】ncRNAネオタクソノミのための大規模解析基盤の開発

本研究では、特定のncRNAタクソンに属する新規ncRNAを、大規模探索するための新しい解析戦略として、計画研究1と連携して、我が国で作成されたGFPタグ付ヒト完全長cDNAリソースとハイコンテンツ顕微鏡システムを組み合わせた、arcRNAによって構築される細胞内構造体のスクリーニング系を開発します。まず、2万種類のcDNAクローン由来タンパク質を発現させ、血清刺激や各種ストレスなどの刺激に応答した細胞内局在変化を経時的に観察します。そこで、特に細胞内で構造体を作るものに注目し、それらの構造体のRNaseへの感受性を検討することによって、arcRNAによって構築された新規細胞内構造体を同定します。

また、新しいゲノム編集技術に用いられる柑橘カイヨウ病菌由来であるTALEタンパク質の発現を至適化させたライブラリーの開発などを行い、ncRNAの局在解析やゲノム編集技術を利用した効率良いncRNA遺伝子改変動物の作製系を整備し、領域内の技術支援に役立てます。

浅原 弘嗣 (ASAHARA, Hiroshi)
  • 東京医科歯科大学
  • 医歯学総合研究科
  • 教授

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