通常の抗体染色に比べ、1次抗体、2次抗体、共に4-5倍の濃度で用いるのが良い。
- 一般的な2次抗体なら50x~ぐらい。
カバーグラスの上で細胞を培養する。厚さは0.17mm
- 凍結切片であれば、PLLコートしたカバーグラス上に切片をとれば良い。
- 通常のカバーグラス#1は0.12-0.17mmと若干薄いので#1.5を用いる。
- Assistentでは0.17±0.01mmに厚さを揃えたものを安価で販売している。
最も良く染まる条件をきちんと出す。
-
2次抗体は
Alexa488/568Cy2/Cy3の組み合わせがおすすめ。(注：TDEでマウントするときはAlexa488は使えない） - 1次抗体によって染色条件は千差万別。
マウント剤にTDEを用いるとAlexa488はの色が若干暗くなる印象がある暗くなるので使わない方が良い。
- それでも使うのならCCDカメラのgainを上げる等で対応。
- Prolong Goldがやはり便利か。高いけど。
- whole mountのサンプルだとTDEによる透明化の効果が期待できるかも。
- でも下のHarvardのリンク先の情報によればZの解像度はTDEの方が良いらしい。でもちょっと大げさな気がするなあ、、、ということで検討中。
TDEマウントでの色素のチョイスは２色ならばCy2-Cy3の組み合わせが良い！！
- なんと驚くべきことにCyanine 系の色素はTDEマウントでむしろ明るくなる！
- Cy2はProlong GoldマウントではAlexa488よりずっと暗いがTDEマウントでは立場逆転。
- 詳しくはTDEのオリジナルの論文を参照。
- 論文読んでから実験しろと、ちょっと前の自分に小一時間ぐらい問いつめたい。。。
- optical effectを考えると現時点での最良のchoiceはTDEマウント、Cy2/Cy3染色。
TDEマウントするとDAPI染色のシグナルが消えてしまい困っていましたが、100ng1µg/mlぐらいでTDEマウント剤に混ぜておけば良いみたいです。
- 論文読んでから実験しろと、ちょっと前の自分に小一時間ぐらい問いつめたい。。。
お役立ちリンク
Rainer Heintzmann Lab.
Harvard Center for Biological Imaging
